乳制品中三聚氰胺检测技术研究发展

观点1：苦味酸法
苦味酸法是国标GB/T9567-1997《工业三聚氰胺>中规定的检测方法。将水加入试样，加热溶解后，加入苦味酸溶液，称量所生成的苦味酸三聚氰胺沉淀的质量，即测得三聚氰胺纯度含量。称试样1g（精确至0.0002g）,置于500mL锥形瓶中，同时加入400mL水，加热溶解；冷却后，加入酚酞指示液3滴，若显色，加入硫酸溶液，直至溶液颜色消失，若有不溶物，需过滤，水洗；把滤液和洗液合并，移入500mL容量瓶中，加水至刻度，仔细振摇混合后，准确吸取100mL置于500mL烧杯里；将此溶液加热至80℃，另加入已加热至80℃的100mL苦味酸溶液，冷却至室温后，保持在15℃以下约8h；用已恒重的玻砂过滤器过滤，之后，先用约100mL苦味酸三聚氰胺的饱和溶液洗涤，再用10mL水洗；在100-105℃下经2h烘干玻砂过滤器，置于干燥器中冷却后，称量（精确至0.0002g）求得沉淀物质量。。

升华法
在升华装置中将试样在负压下进行加热，让三聚氰胺完全升华后，称其残渣量，即测得三聚氰胺纯度。称取试样，置于预先干燥了的且已知质量的试样容器里；将试样容器置入减压升华装置内，待完全密闭后，开启真空装置缓缓吸引，并调节装置内的温度，经2小时升华结束；取出试样容器，冷至室温后，称量试样容器的质量。

电位滴定法
袁立勇等利用电位滴定法测定溶液中三聚氰胺的含量。硫酸溶液和三聚氰胺反应生成弱酸性化合物。以pH3为终点指示，通过硫酸溶液的消耗体积计算三聚氰胺的含量。相对标准偏差不大于0.50%。

食品中的检测方法
2007年06月14日，农行行业标准NY/T1372-2007《饲料中三聚氰胺的检测》中规定测定饲料中三聚氰胺的含量方法为高效液相色谱（HPLC）和气相色谱质谱联用法（GC-MS）。2008年10月07日，国家标准GB/T22388-2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》[20]中规定原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺检测方法为高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）和气相色谱-质谱联用法[包括气相色谱-质谱法（GC-MS），气相色谱-质谱/质谱法（GC-MS/MS）]。2008年10月15日，国家标准GB/T22400-2008《原料乳中三聚氰胺快速检测液相色谱法》[21]中规定了液相色谱法作为快速检测原料乳及不含添加物的液态乳制品中三聚氰胺的方法。目前，三聚氰胺的检测方法还包括试剂盒检测法（ELISA）、离子交换色谱-紫外检测法等。

高效液相色谱法（HPLC)
试样中的三聚氰胺用三氯乙酸溶液提取，提取液离心后经混合型阳离子交换固相萃取柱净化，洗脱物吹干后用甲醇溶液溶解，用高效液相色谱仪进行测定。在添加浓度2mg/kg～10mg/kg浓度范围内，回收率在80%～110%之间，相对标准偏差小于10%。称取5g试样，准确加入50ml 10g/L三氯乙酸溶液，加入2ml 22g/L乙酸铅溶液。摇匀，超声提取20min。静止2min，取上层提取液约30ml转入离心管。在10000r/min离心机上离心5min。分别用3ml甲醇，3ml水活化混合型阳离子交换固相萃取柱，准确移取10ml离心液分次上柱，控制过柱速度在1ml/min以内。再用3ml水和3ml甲醇洗涤混合型阳离子交换固相萃取柱，抽干后用氨水甲醇3ml洗脱。洗脱液50℃氮气吹干，准确加入甲醇溶液，涡旋震荡1min，过0.45µm滤膜，上机测定。

气相色谱-质谱联用法（GC-MS和GC-MS/MS）[20]
试样经超声提取、固相萃取净化后，进行硅烷化衍生，衍生产物采用选择离子监测质谱扫描模式（SIM）或多反应监测质谱扫描模式（MRM），用化合物的保留时间和质谱碎片的丰度比定性，外标法定量。其中GC-MS法在添加浓度0.05mg/kg～2mg/kg浓度范围内，回收率在70%～110%之间，相对标准偏差小于10%；GC-MS/MS法在添加浓度0.005mg/kg～1mg/kg浓度范围内，回收率在90%～105%之间，相对标准偏差小于10%。

GC-MS法，称取1g（精确至0.01g）试样于50mL具塞塑料离心管中，加入25mL 1%三氯涡漩振荡30s，再加入15mL三氯乙酸溶液，超声提取15min，加入2mL乙酸铅溶液，用三氯乙酸溶液定容至刻度。充分混匀后，转移上层提取液约30mL至50mL离心试管，以不低于4000r/min离心10min。上清液待净化。若样品中脂肪含量较高，可以先用乙醚脱脂后再用三氯乙酸溶液提取。准确移取5mL的待净化滤液至固相萃取柱中。再用3mL水、3mL甲醇淋洗，弃淋洗液，抽近干后用3mL 5%氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，50℃下氮气吹干。

GC-MS/MS法，称取0.5g（精确至0.01g）试样，加入5mL甲醇水溶液，涡旋混匀2min后，超声提取15min-20min，以不低于4000r/min离心10min，取上清液200μL用微孔滤膜过滤，50℃下氮气吹干。取氮气吹干残留物，加入600μL的吡啶和200μL衍生化试剂，混匀，70℃反应30min后，供GC-MS或GC-MS/MS法定量检测或确证。

液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS
试样用三氯乙酸溶液提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用液相色谱-质谱/质谱法测定和确证，外标法定量。在添加浓度0.01mg/kg～0.5mg/kg浓度范围内，回收率在80%～110%之间，相对标准偏差小于10%。称取1g（精确至0.01g）试样于50mL具塞塑料离心管中，加入8mL 1%三氯乙酸溶液和2mL乙腈，超声提取10min，再振荡提取10min后，以不低于4000r/min离心10min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，做待净化液。若样品中脂肪含量较高，可以用三氯乙酸溶液饱和的正己烷液-液分配除脂后再用SPE柱净化。将上述待净化液转移至固相萃取柱中。依次用3mL水和3mL甲醇洗涤，抽至近干后，用6mL氨化甲醇溶液洗脱。整个固相萃取过程流速不超过1mL/min。洗脱液于50℃下用氮气吹干，残留物（相当于1g试样）用1mL流动相定容，涡旋混合1min，过微孔滤膜后，供LC-MS/MS测定。

试剂盒检测法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay ELISA）
试剂盒检测法即为酶联免疫吸附剂测定，是利用萃取液通过均质及震荡的方式提取样品中的三聚氰胺进行免疫测定的一种方法。
将三聚氰胺HRP酶标记物、标样及样品提取液加入包被三聚氰胺抗体的试验孔中孵育在30min的孵育过程中，样品中的三聚氰胺与HRP酶标记物竞争结合三聚氰胺抗体。孵育完后，倾去孔内液体洗涤除去未结合的三聚氰胺和HRP酶标记物。每孔加入清澈的底物溶液，结合的酶标记物将无色的底物转化为蓝色的物质。孵育30min后终止反应，用酶标仪读取450nm下各孔的OD值。比较未知样品的OD值与标样的OD值，就可计算出样品中的三聚氰胺浓度，最低可检测到10ppb以下的三聚氰胺残留，检测过程约需65min

离子交换色谱-紫外检测法
何强建立离子交换色谱-紫外检测法测定乳制品中三聚氰胺。样品用水和乙腈提取，分析时用LC-SCX离子交换色谱柱分离，浓度为0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（pH3.0）-乙腈（70：30）为流动相，在紫外波长240nm处检测。三聚氰胺为0.5mg/L-100.0mg/L时，质量浓度与色谱峰面积呈良好的线性关系（r=0.9999），最低检出限为1.0mg/kg，加标回收率为93.8%～102.5%，RSD<3.5%。

其他检测法
利用抗原与抗体相互识别的原理，制作出能识别三聚氰胺的抗体试纸，将试纸插入稀释的奶制品中，则可检测出其中是否含有三聚氰胺。使用膜分离技术萃取样品溶液，然后采用紫外可见光度法或化学检验的方法检测样品中三聚氰胺的含量。

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