酶在食品检测中的应用都有什么？具体详细点

观点1：酶免疫技术在食品检测中的应用目前食品受农药、兽药污染的问题仍比较严重，给人们的身体健康带来了危害，尽管国家和政府对此已做了大量的工作，投入了人力、物力，但执行情况仍不尽如人意。其主要原因之一就是缺乏快速、灵敏、简便的检测方法，相关的检测试剂研发速度太慢。免疫分析技术如酶联免疫分析法、胶体全免疫层析试纸法是一种快速、灵敏、简便的分析方法，在国外已被用于食品安全检测，我国也已在临床检验中应用多年。酶免疫测定具有高度的敏感性和特异性，几乎所有的可溶性抗原抗体系统均可用以检测。它的最小可测值达ng甚至pg水平。与放射免疫分析相比，酶免疫测定的优点是标记试剂比较稳定，且无放射性危害。因此，酶免疫测定的应用日新月异，酶免疫测定的新方法、新技术不断发展。但酶免疫测定在食品检测中的应用，应归功于商品试剂盒和自动或半自动检测仪器的问世。酶免疫测定步骤复杂，试剂制备困难。只有用符合要求的试剂和标准化的操作，才能获得满意的结果。商品ELISA试剂盒中应包含包被好的固相载体、酶结合底物和洗涤液等。先进的试剂盒不仅提供全部试剂成分，而且所有试剂均已配制成应用液，并在各种试剂中加色素，使之呈现不同的颜色。ELISA操作步骤多，所需试剂也多，这种有色试剂既方便操作又有利于减少操作错误。ELISA所有仪器除定量测定中必须的出色仪（专用的称为ELISA测读仪）外，洗涤板也极有用。洗涤机的使用不仅省时省工，而且也有利于操作标准化，对中小实验室是实用且易于接受的。但应注意在采用洗板机前，应先对洗板机的性能加以检定，确认各孔的洗涤效果是否彻底，且重复性好。自动化和半自动化ELISA分析仪亦趋成熟，并在大中型临床检验实验室中取得应用。自动化ELISA分析仪有开放系统（Opensystem）和封闭系统（Closesystem）两类。前者适用于所有的96孔板的ELISA测定；后者只与特定试剂配套使用。1 用于细菌及毒素、真菌及毒素、病毒和寄生虫的检测如沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、链球菌、结核分枝杆菌、布氏杆菌、金黄色葡萄球菌肠毒素、黄曲霉毒素等。肝炎病毒、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒等；寄生虫如弓形虫、阿米巴、疟原虫等。2 用于蛋白质、激素、其他生理活性物质、药物残留、抗生素等的检测近年来有关使用酶免疫法测定乳和血浆中有机化学残留物已有报道，这标志着本法在动物性食品卫生监测方面具有新的应用趋势。因其优点，该法已引起了世界各国的重视，并已着手这方面的研究。但是，该法在动物性食品卫生监测中还存在着许多问题，不过，前景还是广阔的。世界卫生组织（WHO）和世界粮农组织（FAO）对这方面的研究给予了许多支持。只要对实际问题进行细致的科学研究并努力追求改进的方法，酶免疫法定会有新的姿态在食品卫生监测领域出现。标准化、商品化的酶免疫试剂盒将会问世，也将给整个食品卫生事业带来新的前景。目前药物残留免疫分析技术主要分为两大类：以为相对独立的分析方法，即免疫测定法（Immuno Assays,IAs）,如RIA、ELISA、固相免疫传感器（Soindphase immunosensor）等；二是将免疫分析技术与常规理化分析技术联用，如利用免疫分析的高选择性作为理化测定技术中的净化手段，典型的方式为免疫亲和色谱(Immuno Affinity Chromatogrphy,IAC)。与常规的理化分析技术相比，免疫分析技术最突出的优点[5]是操作简单，速度快、分析成本低。以使用微量滴板的ELISA为例，免疫测定法取样量小，前处理简单、容量大，仪器化程度低，检测奶与GC/MS或GC/ECD相似，可方便地达到ng/g～pg/g级，分析效率则为HPLC或GC的几十倍。目前大部分抗生素已经建立了免疫测定法，如硫胺二甲基嘧啶、氯霉素、沙拉沙星、链霉素、四环素、魔能霉素等。免疫分析能与其他技术联用。在联用方法中，免疫分析技术既可作为HPLC或GC等测定技术的样品净化或分离手段，如IAC/HPLIAC/GC、HOIAC/HPLC；也可作为其离线或在线检测方法，如HPLC/IA,TLC/IA,CZE/IA,SFC/IA,FIA/IA等，这些方法结合了免疫分析的选择性、灵敏度与HPLC、GC等技术的高速、高效分离和准确检测能力，使分析过程简化、分析成本下降，拓展了待测物范围。在HPLC/IA等分析中，IA一般作为离线检测方法；又称免疫图谱法（Immunograms），适用于液相检测器无响应或分离困难的残留组分的检测。FIA/IA可以实现IA的动态、实时和自动检测，分析速度快，已发展为一种专门的免疫检测技术---FIIA。ELISA试剂盒是目前奶牛场和牛奶公司使用最广泛、快速、灵敏的检测抗生素残留的方法。各类抗生素试剂盒为国外生产，这使得国内的奶及奶制品公司花费较大。如德国拜发公司生产的抗生素检测试剂盒，一个96次检测试剂盒要花3800元，每个样品的检测要花30～50元。对一家中小型奶制品企业而言，每年在抗生素等药物的检测上要花费20万元以上。因此很有必要研制和开发出国产的试剂盒，以降低成本，提高经济效益。3 应用实例以ELISA法检测致泻性大肠埃希氏肠毒素为例，说明ELISA在食品检验中的应用。（1）产毒培养将菌株和阳性及阴性对照菌株分别接种于0.6mLCAYE培养基内，37℃振荡培养过夜。加入20000IU/mL的多粘菌素B0.05mL，于37℃，离心1h，分离上清液，加入0.1%硫柳贡0.05mL，于4℃保存待用。（2） LT检验方法（双抗体夹心法）① 包被：先在产肠毒素大肠埃希氏菌LT和ST酶标诊断试剂盒中取出包被用LT抗体管，加入包被液0.5mL，混匀后全部吸出于3.6mL包被液中混匀，以每孔100μL量加入到40孔聚苯乙烯硬反应板中，第一孔留空作对照，于4℃冰箱湿盒中过夜。② 洗板：将孔中溶液甩去，用洗涤液I洗3次，甩尽液体，翻转反应板，在吸水纸上拍打，去尽孔中残留液体。③ 封闭：每孔加100μL封闭液，于37℃水浴中1h。④ 洗板：用洗涤液II洗3次，操作同上。⑤ 加样品：每孔分别加各种试验菌株产毒培养液100μL，37℃水浴中1h。⑥ 洗板：用洗涤液II洗3次，操作同上。⑦ 加酶标抗体：先在酶标LT抗体管中加0.5mL稀释液，混匀后全部吸出于3.6mL稀释液中混匀，每孔加100μL，37℃水浴中1h。⑧ 洗板：用洗涤液II洗3次，操作同上。⑨ 酶底物反应：每孔（包括第一孔）各加基质液100μL，室温下避光作用5～10min，加入终止液50μL。⑩ 结果判定：以酶标仪在波长492nm测定吸光度OD值，待测标本OD值大于3倍以上为阳性，目测颜色为橘黄色或明显高于阴性对照为阳性。（3） ST检测方法（抗原竞争法）① 包被：先在包被用ST抗原管中加0.5mL包被液，混匀后全部吸出于1.6mL包被液中混匀，以每孔50μL加入于40孔聚苯乙烯软反应板中，加液后轻轻敲板，使液体布满孔底。第一孔留空作对照，于4℃冰箱湿盒中过夜。② 洗板：用洗涤液I洗3次，操作同上。③ 封闭：每孔加100μL封闭液，于37℃水浴中1h。④ 洗板：用洗涤液II洗3次，操作同上。⑤ 加样品及ST单克隆抗体：每孔分别加各实验菌株产毒培养液50μL，稀释的单克隆抗体50μL（先在ST单克隆抗体管中加0.5mL稀释液，混匀后全部吸出于1.6mL稀释液中，混匀备用），37℃水浴1h。⑥ 用洗涤液II洗3次，操作同上。⑦ 加酶标记兔抗鼠Ig复合物：先在加酶标记兔抗鼠Ig复合物管中加0.5mL稀释液，混匀后全部吸出于3.6mL稀释液中混匀，每孔加100μL，37℃水浴1h。⑧ 用洗涤液II洗3次，操作同上。⑨ 酶底物反应：每孔（包括第一孔）各加基质液100μL，室温下避光5～10min，再加入终止液50μL。⑩ 结果判定：以酶标仪在波长492nm下测定吸光度（OD）值：（阴性对照OD值-待测样本OD值）/阴性对照OD值×100%≥50% 为阳性目测无色或明显淡于阴性为阳性。结论ELISA与其他技术相比，具有灵敏度高，特异性强，仪器设备要求不高，测定成本低，方法快速、简便，试剂保存时间较长，自动化程度高，无放射性同位素污染等优势；但同时也存在局限性，比如不能同时分析多种成分，对试剂的选择性高，对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应。所以未来的发展趋势就在于开发高度免疫原性的重组抗原．研究多项标记快速测定方法，将酶体外定向进化应用到检测中以及研发种类更多的全自动酶联免疫测定仪。这样将扩大检测的范围，提高检测的稳定性，加强标准化，同时也促进了商品化的应用。另外，还应与其他检测技术如色谱、PcR等结合起来。实现强强联合，优势互补。在未来食品安全的快速检测中发挥更加突出和重要的作用。; 观点2： 3个字假正经

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